Holandskí vedci kombinujú CRISPR a bioluminiscenciu v experimentálnom teste preinfekčné choroby

Novovyvinutý nočný proteín by podľa holandských vedcov mohol urýchliť a zjednodušiť diagnostiku vírusových ochorení.
Ich štúdia, publikovaná v stredu v ACS Publications, opisuje citlivú, jednokrokovú metódu rýchlej analýzy vírusových nukleových kyselín a ich vzhľadu pomocou žiarivo modrých alebo zelených proteínov.
Identifikácia patogénov detekciou ich odtlačkov nukleových kyselín je kľúčovou stratégiou v klinickej diagnostike, biomedicínskom výskume a monitorovaní bezpečnosti potravín a životného prostredia.Široko používané testy kvantitatívnej polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) sú vysoko citlivé, ale vyžadujú sofistikovanú prípravu vzorky alebo interpretáciu výsledkov, čo ich robí nepraktickými pre niektoré zdravotnícke zariadenia alebo prostredia s obmedzenými zdrojmi.
Táto skupina z Holandska je výsledkom spolupráce medzi vedcami z univerzít a nemocníc s cieľom vyvinúť rýchlu, prenosnú a ľahko použiteľnú metódu diagnostiky nukleových kyselín, ktorú možno použiť v rôznych prostrediach.
Boli inšpirované zábleskami svetlušiek, svetluškami a drobnými hviezdami vodného fytoplanktónu, všetko poháňané fenoménom nazývaným bioluminiscencia.Tento efekt žiary v tme je spôsobený chemickou reakciou zahŕňajúcou proteín luciferázy.Vedci začlenili luciferázové proteíny do senzorov, ktoré vyžarujú svetlo na uľahčenie pozorovania, keď nájdu cieľ.Aj keď sú tieto senzory ideálne na detekciu v mieste starostlivosti, v súčasnosti im chýba vysoká citlivosť potrebná na klinické diagnostické testy.Zatiaľ čo metóda úpravy génov CRISPR môže poskytnúť túto schopnosť, vyžaduje si veľa krokov a ďalšie špecializované vybavenie na detekciu slabého signálu, ktorý môže byť prítomný v zložitých, hlučných vzorkách.
Výskumníci našli spôsob, ako skombinovať proteín súvisiaci s CRISPR s bioluminiscenčným signálom, ktorý možno detegovať pomocou jednoduchého digitálneho fotoaparátu.Aby sa ubezpečili, že je dostatok vzorky RNA alebo DNA na analýzu, výskumníci vykonali amplifikáciu rekombinázovej polymerázy (RPA), jednoduchú techniku, ktorá funguje pri konštantnej teplote okolo 100 ° F.Vyvinuli novú platformu nazvanú Luminiscent Nucleic Acid Sensor (LUNAS), v ktorej sú dva proteíny CRISPR/Cas9 špecifické pre rôzne susediace časti vírusového genómu, pričom každý má k nim vyššie pripojený jedinečný luciferázový fragment.
Keď je prítomný špecifický vírusový genóm, ktorý vyšetrovatelia skúmajú, dva proteíny CRISPR/Cas9 sa viažu na cieľovú sekvenciu nukleovej kyseliny;dostanú sa do tesnej blízkosti, čo umožní, aby sa intaktný luciferázový proteín vytvoril a vyžaroval modré svetlo v prítomnosti chemického substrátu..Na zohľadnenie substrátu spotrebovaného v tomto procese výskumníci použili kontrolnú reakciu, ktorá vyžarovala zelené svetlo.Skúmavka, ktorá mení farbu zo zelenej na modrú, znamená pozitívny výsledok.
Výskumníci testovali svoju platformu vyvinutím testu RPA-LUNAS, ktorý detekujeRNA SARS-CoV-2bez zdĺhavej izolácie RNA a demonštroval svoj diagnostický výkon na vzorkách nazofaryngeálnych výterov zCOVID-19pacientov.RPA-LUNAS úspešne detegoval SARS-CoV-2 do 20 minút vo vzorkách s vírusovou záťažou RNA len 200 kópií/μl.
Vedci veria, že ich test môže ľahko a efektívne odhaliť mnoho ďalších vírusov.„RPA-LUNAS je atraktívny pre testovanie infekčných chorôb v mieste starostlivosti,“ napísali.